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非洲豬瘟病毒檢測試劑盒說明書(實時熒光PCR法)

作者:sanli  轉載自:  發布日期:2019-4-26

非洲豬瘟病毒檢測試劑盒說明書(實時熒光PCR法)

通用名稱:非洲豬瘟病毒檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

英文名稱:African Swine Fever virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】 25T/ & 50T/

【預期用途】

本試劑盒適用于非洲豬瘟病毒檢測,可用于臨床非洲豬瘟病毒感染的輔助診斷,但不作確診使用。

【檢驗原理】

本試劑盒針對非洲豬瘟病毒的高度保守區域設計特異性引物和探針,在反應體系中含非洲豬瘟病毒基因組模板的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監測和輸出,實現檢測結果的定性分析。

非洲豬瘟病毒檢測試劑盒說明書【主要組成成份】

序號

組成

25T/

50T/

A

純化柱

25

50

2ml 收集管

25

50

裂解液(Buffer AL

10ml

20 ml

洗滌液(Buffer RW

50ml

100 ml

Nuclease Free Water

5 ml

10 ml

核酸提取說明書

1

1

B

ASFV  PCR反應液

437.5 μL×1

875 μL×1

ASFV混合酶液

 62.5 μL×1

125 μL×1

ASFV陽性對照

 40 μL×1

 40 μL×1

ASFV陰性對照

 40 μL×1

 40 μL×1

蛋白酶K

600μL×1

1.2ml×1

說明書

1

1

注:陰性對照為豬基因組DNA,陽性對照為失去活性的非洲豬瘟病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。

【適用儀器】多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢

2.肌肉或內臟樣品:脾臟,其次為扁桃體、淋巴結、腎臟、骨髓等取少量樣品(23克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉入無菌離心管中,3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢;

3.鈍緣軟蜱:將收集的鈍緣軟蜱放入有螺旋蓋的樣品瓶中進行樣本提??;

4.應避免標本間交叉污染。

5.標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存于-80℃以下,避免反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備(試劑準備區)

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

2)核算當次實驗所需要的反應數(n),并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(1T+陽性對照數(1T+誤差預留量(1T+樣本數

單反液配制表(每份)

PCR反應液

17.5 μL

混合酶液(Taq+UNG酶)

 2.5 μL

 

在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備(樣本處理區)

QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉移到PCR儀器上。

4. PCRPCR擴增區)

1)取樣本處理區準備好的PCR反應管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序。

2)按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

 

反應體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集非洲豬瘟病毒熒光信號

PCR

反應

條件

步驟

條件

循環數

UNG處理

    502分鐘(min

1

預變性

953分鐘(min

1

預擴增

955秒(s

5

5540秒(s

PCR擴增

955秒(s

40

5540秒(s

(此階段結束時采集熒光信號)

 

注:ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,設置淬滅基團選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

 1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct≤35。

 2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數增長期。

2.標本結果判定:

1)陽性:標本檢測結果Ct≤35或有明顯指數增長期。

2)可疑:標本檢測結果Ct值在3538范圍內。此時應對標本進行重復檢測,如重復實驗結果Ct值仍在3538范圍內,有明顯指數增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

3)陰性:標本檢測結果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

通道及檢測結果

標本檢測結果解釋

FAM

陽性(+)

標本中檢出非洲豬瘟病毒DNA

陰性(-)

標本中未檢出非洲豬瘟病毒DNA

【檢驗方法的局限性】

當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出限時可能會發生假陰性的結果。

被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。

樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發生交叉污染,則容易得到假陽性結果。

【產品性能指標】 產品的低檢出限為102 Copies/mL,產品CV≤5%。

非洲豬瘟病毒檢測試劑盒說明書【注意事項】

整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作,各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區應該配有紫外線殺菌裝置。

為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。

每次實驗應該設置陰、陽性對照。

試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。

試劑盒內所配陰性和陽性對照在次使用前應全部轉移至標本準備區,并單獨存放。

為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用。

ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。

非洲豬瘟病毒檢測試劑盒說明書



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